u乐国际主题:【讨论】提问帖(517)色谱柱填料的孔径对样品的分析分离有什么影响(答案已出)

  孔径太小□□□□,待测物不易流出□□□,分析时间长□,展宽严重 □□□□□。 孔径太大则很可能导致组分分不开 □□□□。 在做凝胶色谱时□□□□□□,需要先大致估计下待分析物的分子量□,然后选择 合适的柱子□□□□□□,如果不知道粒径□□□□,可先用大孔径的先试试□□□,接着再用 小粒径的以达到更高的精度□□。市售的柱子上都有该柱适用的分子量 范围□□□,一般选待测物分子量在色谱柱的最大分子量的20%-80%宜

  填料的孔径太小□,待测物不易流出□□□,分析时间长□□□,展宽严重□;孔径太大则很可能导致组分分不开□□□。在做凝胶色谱时□□,需要先大致估计下待分析物的分子量□□□□,然后选择合适的柱子□,如果不知道粒径□,可先用大孔径的先试试□□□□,接着再用小粒径的以达到更高的精度□。市售的柱子上都有该柱适用的分子量范围□□□,一般选待测物分子量在色谱柱的最大分子量的20%-80%为宜□。

  大多数用于HPLC分离的柱填料使用硅胶微粒(作担体)□□□。基于多孔聚会物担体或其它材料的色谱柱也已商品化□,这些非硅胶填料由于有其特殊的应用□□,以后再作讨论□□□。由于硅胶担体与键合的有机表层(如C18或C8)□□□□,应用范围广□□□,我们将作重点讨论□□□□。

  图5-1所示为HPLC中常用的几种微粒类型□□。由于全多孔微球很好地兼顾了众多理想的性质□□□:效能□□□□□、样品荷载量□□□□、耐久性□□□、方便性以及有效利用率等□□□□,所以最为常用□□□□。这些微粒有不同的粒径□□□□、孔径和表面积供选择□□□,所以用这些物质能建立各类HPLC方法□□□□。

  实心微球型微粒固定相有一实芯核□□□,起作用的是其表面很薄的外壳□。u乐国际,这些硅胶或聚会物基质的微粒□□□,通常为1□□□□.5~2□□.5μm□□,因为其快速传质的动力学过程□□□□□,对大分子有突出的福利效能□□□□。因为这些实心超小微粒的表面积较小□□,样品容量有限□□□□,所以仅适于分析型HPLC□□□□□。这种超小微粒的色谱柱出峰极为尖锐(小体积)□,因此要求所用HPLC仪器的柱外峰展宽因素极小□□□□□,以避免峰展宽□□□。

  灌注色谱填料包含孔径达4000~8000A0(艾)的贯穿孔□□,而且在这些贯穿孔网络中还有较小的内联孔(如300~1000A0(艾))□。在高流速时□□,溶质可通过对流和扩散的共同作用□,进入(并离开)该孔结构□□□□。其效果减少了峰展宽□□□,所以大的多孔微粒在柱效方面与小微粒相当□□□□□□,但压力降却小得多□。目前这种类型填料的使用还较少□□□,因此□□□□,其实用性还有待于进一步探讨□□□。不过□□□□,这种填料似乎非常适于大分子如蛋白质的制备分离□□□,用于小分子的日常分析分离则较少□□□□。

  颗粒大小(粒度)在HPLC中极为重要□□□□。约5μm的微粒直径很好地兼顾了分析柱的柱效□□□□□、反压和寿命□□。更小的多孔微粒(如3μm)对快速分离很有用□□。小至1□□.5μm的薄壳微粒对极快速地分离蛋白质等大分子较有用□□。较窄的粒度分布(±50%均值)能保证填充床的稳定□、高效和压力降最小□□□□。总的说来□,3或5μm全多孔微球填充HPLC色谱柱□□□□□□,能满足大多数分离的需要□□□,我们推荐大多数的方法建立用这些粒度的色谱柱□□□□□。

  表5-1总结了HPLC分离用微粒的理想的物理特性□□□□□,以及它们的重要性□□□。一般使用7~12nm(70~120 A0(艾))孔径的全多孔微粒□□□□□。表面积150~400m2/g的全多孔微粒分离小分子较有利□□□□。表5-2列出一些窄孔径C18商品柱的典型物理性质□□□□□□。对于分子量大于10000Da分子的分离□,需用孔径大于15nm的微粒□□□□□□,使这些溶质容易进入到微孔结构内部的活性表面□。各种情况下□,都应保证溶质在微孔里能迅速扩散与柱效良好□□□。孔径至少是溶质流体动力学直径的4倍□□,才能确保溶质的有限扩散不至于使柱效下降□□□□□。大孔微粒的比表面积有10~150m2/g不等□□□□□□,取决于微孔直径的大小□□□□□;孔径越大表面积越小□□□□□。

  孔径□,指的是硅胶表面上的小孔的直径□,是一个平均值□□□□。常规的液相色谱柱都是在硅胶表面健合特定的官能团□□□□□□,孔径的大小影响官能团健合的密度□□□□。同等粒径的硅胶□□□□□,孔径越大□□□□,硅胶的比表面积越小□,硅胶表面健合的官能团密度越低□□□□□,也就是C%越低□□□□□;反之□□,孔径越小□□,比表面积越大□□□,官能团健合的密度越高□□。另外□□□□□□,如果用来分离生物大分子□□□□□,就要选择孔径较大的(例如300A)的填料□,这样才会得到充分的保留□□□□。

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