硅胶填料的孔径和粒径大小对一种小分子蛋白质——胰岛素分离doc

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  硅胶填料的孔径和粒径大小对一种小分子蛋白质胰岛素分离硅胶填料的孔径和粒径大小对一种小分子蛋白质胰岛素分离硅胶填料的孔径和粒径大小对一种小分子蛋白质胰岛素分离的影响应用报告生物制药摘要作者本文采用不同孔径和粒径的硅胶填料色谱柱对胰岛素这种小分子蛋白质进行分离。对不RongjieFu同孔径(包括、、、、)和粒径(包括、、安捷伦科技有限公司(上海)mm、)填料色谱柱的柱效和分辨率进行了对比。英伦路号mm上海对比结果显示,胰岛素分析采用较大孔径填料的色谱柱可获得更高的柱效。填料孔径大于中国的色谱柱即可以使胰岛素达到高效分离,而采用的大孔径色谱柱对于该中等分子量分子的分析就没有必要。采用小粒径填料色谱柱分析胰岛素也可获得较高柱效。这MaureenJoseph一点通过改变粒径大小()进行分析得到证实。mmmAgilentTechnologies,IncCentervilleRoad色谱柱使用了孔径,粒径的表面多孔颗粒填料,使它AgilentPoroshellmWilmington,DE成为胰岛素分析的最佳选择。USA前言材料与方法硅胶填料的粒径和孔径是反相分析中色谱柱选择的重要参HPLC条件HPLC数。以下(包括亚)的小粒径填料色谱柱因其可实现mm色谱柱所有色谱柱均为色谱柱,满足药典规定的十八烷基C高柱效和快速分离而得到广泛应用。另外,硅胶颗粒的孔径在选()化学键合多孔硅胶键合相的要求C流速择色谱柱时也应充分考虑。对于分子量小于的分子通常mLminDa进样量L选择小孔径()填料的色谱柱,分析低分子量蛋白质柱温C()时通常选择孔径填料的色谱柱,而高分KDa检测波长nm子量蛋白质和疫苗则需要采用更大孔径()填料的色流动相,A:B谱柱。硫酸盐缓冲液(将无水硫酸钠溶于A:molLg水中,加入磷酸,并用乙醇胺调节mLmLpH虽然分析小分子蛋白质,如分子量约为的胰岛素,可采Da至,混匀)用小孔径填料的色谱柱,但也需要对较大孔径填料色谱柱的分析乙腈B:效果进行评价,选择合适填料孔径的色谱柱可获得最高的柱效。过小的孔径会限制分子在孔内外的扩散,采用适当填料孔径的色材料谱柱可获得较高的柱效。为了得到最高的柱效,应选用较小粒径样品和最佳孔径的填料。猪胰岛素(由中国食品药品检定研究院提供)最佳孔径和粒径的研究采用规定的以等度流动相洗脱测定USP色谱柱胰岛素的方法进行。通过考察不同孔径(包括、、,×,(部件号)AgilentZORBAXSBCmmm、、)和不同粒径(包括、、mm,(部件号)AgilentZORBAXEclipsePlusC,×mmm、)填料色谱柱的柱效和分辨率,对比其色谱性能。,(部件号)mmAgilentZORBAXSBC,×mmm,(部件号)AgilentTCC,×mmm同时考察了不同的颗粒类型,包括表面多孔颗粒和全多孔颗粒。(部件号)AgilentZORBAXSBC,×mm,m本应用报告的最终结果得到了实现最高的柱效和分辨率,同时满(部件号)AgilentZORBAXEclipsePlusC,×mm,m足中国药典和美国药典规定方法要求的推荐色谱柱。(部件号)AgilentZORBAXSBC,×mm,m(部件号)AgilentZORBAXEclipsePlusC,×mm,m(部件号)AgilentPoroshellSBC,×mm,m(部件号)AgilentPoroshellECC,×mm,m色谱系统AgilentSLLC系统,配备二元泵、柱温箱(TCC)、高效自动进样器和二极管阵列检测器(DAD)。结果与讨论我们比较中采用的第四根色谱柱为()色谱柱,AgilentTCC硅胶孔径对柱效和分辨率的影响其孔径为,介于、和之间。该色谱柱的柱为了探讨硅胶孔径在胰岛素分离过程中对柱效、分辨率和拖尾因效也比小孔径色谱柱的柱效高出两倍多,此结果表明对于分析分子的影响,我们使用种不同孔径,填料粒径为的传统色m子量为的胰岛素,没有必要采用孔径填料的色谱Da谱柱(如图所示),采用相同的方法对胰岛素进行分析。采用柱,但是为了使该分子量的胰岛素分子完全进入孔内实Da最小孔径为和的,色谱柱和SBCmEclipse现高效分离,必须采用孔径大于填料的色谱柱。,色谱柱对胰岛素进行分析时,得到的柱效最低。PlusCm当我们更详细地比较四根色谱柱的测试结果时,我们发现m孔径从到的微量增加极小地提高了胰岛素分析的柱效。它们的保留能力有些不同。这四根色谱柱有不同的比表面积和键()和色谱柱均AgilentTCCAgilentZORBAXSBC合相类型。其中,色谱柱填料的比表面积最小,大约SBC使用较大孔径的填料,分析胰岛素获得了更高的柱效。孔为,其次是色谱柱,mgAgilentZORBAXEclipsePlusC径填料的色谱柱通常用于分子量大于分子的分析。如Da其填料的比表面积为,接下来是色谱柱,为mgSBC图所示,从填料孔径小于的色谱柱到填料孔径为,最后是()色谱柱,为。最小孔mgTCCmg的色谱柱,胰岛素分析的对比结果显示后者的柱效比前者高出两径的和色谱柱的保留能力最为相似,EclipsePlusCSBC倍多。最小孔径的色谱柱(色谱柱)和AgilentZORBAXSBC当然它们的比表面积并不是最小。胰岛素分子如果不能完全进入最大孔径的色谱柱(色谱柱)对比发现后者的峰形也SBC孔内,并与键合相充分作用,填料的保留能力将受到削弱。有显著改善。这两根色谱柱仅填料孔径不同,色谱柱填料的键合和色谱柱填料上的键合极为不EclipsePlusCSBCC相类型和粒径均相同。这种对比最为确切,并且清楚地指出为实同。色谱柱填料的碳载量低,未封端。而SBCEclipsePlus现胰岛素有效的分离,必须采用填料孔径大于的色谱柱进行色谱柱填料的碳载量高、键合密度大,并且封端彻底。虽然C分析。键合类型的改变有助于改善峰形,但是并没有改变其保留能力,因为胰岛素并没有与孔内的键合相充分作用。mAUANRsAgilentZORBAXSBCTfN×mm,mTfmAUNRsTfAgilentZorbaxEclipsePlusCN×mm,mTfmAURsAgilentTCCNN×mm,mTfTfmAUNRsTfAgilentZORBAXSBCN×mm,mTf图采用不同孔径填料的,色谱柱分析得到的色谱图×mmm色谱柱填料的比表面积最小,但是品保留时间的变化更大,因此可容易地大幅度调整保留时间。同AgilentZORBAXSBC其保留能力仅比小孔径填料色谱柱的略低。一旦胰岛素可以进入时分辨率会略微降低,但如果保留时间和其它填料色谱柱m填料孔中,与孔内所有的键合相相互作用,它就会得到更好的保一致,其分辨率也会相似。留。即使采用无封端的键合相分析,这种更高效的孔内保留也有对比这四根填料色谱柱的分析结果可以得出,的颗m效改善了色谱峰的峰形。()色谱柱填料的比表AgilentTCC粒孔径是足够大的,可使胰岛素分子进入颗粒孔内以实现高效分面积最大,保留能力最强,这很可能是由于分子可以进入填料所离。颗粒孔径仅大于时太小,而对于中等分子量化合物的有孔中,使得样品保留随硅胶颗粒比表面积()增加而mg分析,选用孔径的填料也没有必要。增大。表不同孔径填料色谱柱每米的理论塔板数m()色谱柱的保留时间非常长,超过了分AgilentTCCNm钟,不太理想。因此使用()色谱柱时,可通过增大流TCC峰动相中有机相的比例,来大幅度地缩短保留时间,同时仍保持良峰好的峰型和柱效(如图所示)。流动相中有机相仅增加时,保留时间即从分钟缩短至分钟。当流动相中有机相比例改变时,大分子(如蛋白质)样品保留时间的变化比小分子样mAUNTfARsNTfmAURsNTfNTf图使用(),,色谱柱,改变流动相中有机相比例后分析的色谱图AgilentTCC×mmm表不同粒径填料的色谱柱每米的理论塔板数AgilentZORBAXSBC硅胶粒径的影响NmSBCmSBCmSBCm在方法开发中,直到世纪年代中期,色谱柱通常采HPLC峰用的标准填料粒径为,那时填料粒径为的色谱柱刚mm峰刚出现并逐渐普及。最近,由于对高速和高分辨率分析的需求,色谱工作者通常选用粒径小于或填料色谱柱,如mm填料的色谱柱。m表三种不同粒径填料的色谱柱每米的理AgilentZORBAXEclipsePlusC论塔板数本文中分别在、和填料的mmmAgilentZORBAXNmPlusmPlusmPlusm色谱柱和色谱柱上进SBCAgilentZORBAXEclipsePlusC峰行胰岛素的分析。为了确保不同长度色谱柱的数据可以相互比峰较,按色谱柱长度,以每米柱长的理论塔板数()表示柱Nm效。表、中的数据表明,使用较小的颗粒色谱柱可获m得更高柱效。虽然这些色谱柱填料并不是最理想的孔径条件,但使用更小粒径填料的色谱柱仍会获得柱效的改善,正如本实验中对胰岛素的分析。mAUAgilentZORBAXSBCA×mm,mNRsTfNTfmAUAgilentZORBAXSBCNRs×mm,mTfNTfmAUAgilentZORBAXSBCN×mm,mRsTfNTf图采用不同粒径填料的AgilentZORBAXSBC色谱柱分析的色谱图mAUAAgilentZORBAXPlusCNRs×mm,mTfNTfmAURsNAgilentZORBAXPlusC×mm,mTfNTfmAUAgilentZORBAXPlusCNRs×mm,mTfNTf图采用三种不同粒径填料的色谱柱分析的色谱图AgilentZORBAXEclipsePlusC粒孔内(如图所示)。表列出了采用颗粒粒径为和m表面多孔色谱柱与全mAgilentPoroshell的四种色谱柱每米柱长的理论板数(),表明当采用mNm多孔亚色谱柱的比较m色谱柱时能获得较高的柱效。Poroshell迄今为止,所有对比的色谱柱都是全多孔填料色谱柱,其具有广泛的孔径和粒径类型可供选择。u乐国际,,AgilentPoroshellm采用填料色谱柱时,柱压大约为,而采用mbar色谱柱的表面多孔填料颗粒具有孔径和亚粒径。m色谱柱时,柱压则低于。两类色谱柱都可Poroshellbar孔径大于,但小于之前比较的孔径。此外,用于标准仪,但色谱柱更为适用,这是因为HPLCPorshell众所周知在分离小分子(小于)样品时,颗粒与Dam它与填料粒径为的色谱柱相比,能降低大约的m亚颗粒色谱柱的性能相似。对于分子量约的分mDa柱压。子,如胰岛素,则需要进一步的考察比较。图展示了色谱柱与AgilentPoroshellSBCm图展示了两种不同键合相的色谱柱分别与它们Poroshell()色谱柱相比,能提供更高的柱效。色谱图显AgilentTCC最相近的粒径填料的及mAgilentZORBAXSBC示,采用()色谱柱时使用含有机相的流动相,TCC色谱柱直接比较的色谱图。AgilentZORBAXEclipsePlusC能使保留时间更为相近。对比两根色谱柱,柱效的提高得益于前这些色谱图表明,色谱柱能提供两PoroshellSBC者填料小粒径、大孔径的特点。倍于色谱柱的柱效。这是由于孔径较大,组SBC表采用和亚色谱柱获得的每米理论塔板数AgilentPoroshellm分能更为迅速地于孔中扩散。对比AgilentZORBAXEclipse色谱柱和色谱柱的色谱PlusCAgilentPoroshellECCSBC,Poroshell,PlusC,Poroshell,NmmSBC,mmECC,m图时,我们发现颗粒孔径为的色谱柱同样比颗粒孔径为峰的色谱柱的柱效更高。另外,两根色谱柱均Poroshell峰使胰岛素色谱峰峰型得到改善,这是由于胰岛素更容易进入其颗mAUAgilentZORBAXSBCA×mm,mNNTfNbarmAUAgilentPoroshellSBC×mm,mNNTfbarTfmAUAgilentZORBAXEclipsePlusC×mm,mNNTfbarTfmAUAgilentPoroshellECC×mm,mNNbarTfTf图采用和亚色谱柱获得的对照色谱图AgilentPoroshellmmAUAAgilentTCC×mm,mNTfNRsTfmAUNAgilentPoroshellSBC×mm,mTfRsNTf图采用色谱柱和()色谱柱获得的对照色谱图AgilentPoroshellSBCAgilentTCC

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