u乐国际综述:色谱柱及填料技术最新进展和发展趋势

  高效液相色谱(HPLC)是一种现代分离、分析方法。20世纪60年代以来,HPLC作为一种分析技术在生命科学、环境科学、药物分析等领域的应用日益普遍。其中色谱填料可谓是色谱技术的核心,它不仅是色谱方法建立的基础,而且是一种重要的消耗品。色谱柱作为色谱填料的载体,当之无愧被称为色谱仪器的“心脏”。高性能的液相色谱填料一直是色谱研究中最丰富、最有活力、最富于创造性的研究方向之一。

  近年来,液相色谱填料技术呈现二大趋势。 第一个趋势是快速液相,利用亚 2 µm小粒径硅胶、核壳型硅胶;第二大趋势是越来越丰富的选择性。下面就这二大趋势做一个简单介绍。

  硅胶基质的色谱填料因为其优异的色谱性能是目前应用最为广泛的液相色谱填料,尤其是针对有机小分子的分离和分析,硅胶基质的色谱填料占据绝大多数的市场份额。最近10年,这个领域最激动人心的进展是基于以下二个方向的快速液相技术的发展。

  从2004年Waters公司推出UPLC仪器,超高效液相色谱技术以其快速、高分离度和高灵敏度的优势得到了广泛的应用。而这种技术的核心是基于亚 2 µm小粒径硅胶的色谱填料。当填料颗粒小于2 µm时,不仅柱效明显提高,而且随着流速的增加,分离效率并不降低。采用高流速可将分离速度和峰容量扩展到一个新的极限,但同时柱压也显著升高。小粒径填料需要使用压力更高的超高效液相色谱仪系统,对色谱柱的生产工艺也有更高的要求,必须解决色谱柱的装填难度大、柱头容易漏液、填料容易堵塞等问题。目前,除了国际知名色谱仪器和色谱柱公司(如Waters、Agilent、Phenomenex)生产UHPLC色谱柱,国内的色谱柱厂家也陆续推出此类产品。虽然UHPLC仪器还是国际知名品牌垄断市场的情况, 但是国产的UHPLC色谱柱已经可以取代进口品牌。 图1为月旭公司Ultimate XB-C18 UHPLC色谱柱(2.1×100 mm, 1.8 µm)对奶制品中黄曲霉毒素M 1、u乐国际,M 2测定的色谱图。

  核壳型(core-shell)色谱填料是由著名色谱科学家 Jack Kirkland 在2006年研制成功的一种新型色谱填料。它是将多孔硅壳熔融到实心的硅核表面而制备的。这些多孔的“光环”状颗粒具有极窄的粒径分布和扩散路径,可以同时减小轴向和纵向扩散,允许使用更短的色谱柱和较高的流速以达到快速、高分辨率分离。并且,核壳型色谱柱所产生的反压明显低于UHPLC色谱柱,低反压可以使仪器承受压力降低,使得在常规的液相仪上就能够实现超高效液相仪的分离效果。但是,核壳型色谱柱对仪器的柱外死体积要求高、且柱容量小于全多孔色谱填料,因而并不适用于大规模的制备液相分离需求。

  过去3-5年全球的色谱研究人员发表了大量的有关核壳型色谱填料的学术文章,但是其在工业界的应用是一个渐进式推进的过程,不会一下子大面积被采用。国内还没有报道有国内厂家生产核壳型填料。

  液相色谱技术的广泛应用也得力于近年来各种色谱填料技术的发展为色谱分离提供了越来越多样的选择性。近年来人们制备了大量的含有不同键合基团的色谱填料以增强色谱柱的选择性,从而满足实际样品分离的需要,例如亲水作用色谱(HILIC)填料、立体保护键合色谱填料、极性嵌入反相色谱填料、有机-无机杂化色谱填料、亲水性体积排阻色谱填料、混合模式色谱填料、手性色谱填料以及聚合物基质色谱柱填料等。

  1、HILIC色谱填料。它采用极性固定相和含有一定水的水溶性有机溶剂为流动相,不仅克服了正相色谱和反相色谱对极性化合物分离的不足,而且提供了与反相色谱截然不同选择性,在强极性和离子型化合物如氨基酸、碳水化合物和多肽等的分离中发挥着重要作用。并且,由于其流动相含有高浓度的有机溶剂,有利于增强电喷雾离子源质谱的离子化效率,进而提高其灵敏度,与质谱具有很好的兼容性。过去5-6年HILIC模式色谱柱的应用增长非常快。目前商品化的HILIC色谱填料种类繁多,基于硅胶基质的HILIC填料包括裸硅胶、氨基、氰基、二醇基、酰胺型以及两性离子型等。目前生产HILIC色谱填料的国内公司主要有月旭、艾杰尔、迪马以及赛分等公司。

  2、极性嵌入反相色谱填料。它通过在硅胶键合烷基链的中下部镶嵌一些极性基团,如烷基胺、酰胺、季铵或者氨基甲酸酯等极性基团来降低未反应硅醇基活性和改善对极性化合物的保留能力。这种填料具有的最大优势是减少了填料表面游离硅羟基与碱性化合物间的“次级保留”作用,从而改善碱性化合物峰型的拖尾,而且由于极性基团的嵌入,增强了对极性化合物的保留,提供和普通C18很不一样的选择性。月旭公司的Ultimate Polar-RP色谱柱装填的即为该类型色谱填料。

  3、立体保护键合相。它是在硅胶的烷基链侧链键合含异丙基和异丁基的C18固定相。由于在C18烷基链上引入了较大的基团以及立体效应,阻碍了硅醇基与分析物的相互作用,因而对碱性化合物的分离呈现出对称的峰型并具有良好的柱效,防止碱性化合物在色谱柱上的拖尾,并且在低pH值时有较高的水解稳定性。月旭Ultimate LP色谱柱填充的即为此类型的色谱柱填料,特别适合在极低pH条件下(例如pH=0.8)分离极性化合物。此款色谱柱可以很好地取代市场上广泛应用的安捷伦 Zorbax SB 色谱柱。

  4、有机-无机杂化色谱填料。它是在超高纯全多孔硅胶微球基质表面涂覆一层厚度均匀的有机-无机杂化层,进而提高填料的pH耐受范围和应用能力的一种填料(其填料结构示意图如图4所示)。这种类型的填料能够耐受pH值很高的流动相,并且具有很好的pH值稳定性,它的pH耐受范围可以达到1.5-12,而常规的硅胶基质色谱填料pH值范围一般仅为2-8;它能够耐受各种缓冲液体系,柱寿命长。目前,月旭科技的Xtimate反相填料、菲罗门公司的Gemini NX均是属于此类有机-无机杂化硅胶色谱填料。Waters 公司的X-Bridge 色谱填料采用的是其专有的有机-无机整体杂化技术,不是表面涂覆。

  5、亲水性体积排阻(SEC)色谱填料。它是在超高纯全多孔硅胶表面包覆一层具有良好稳定性的亲水性聚合物的体积排阻色谱填料,其填料的作用基团为二醇基(填料结构示意图如图5所示)。其填料表面因受二醇基官能团保护而不与蛋白质相互作用。使得蛋白、生物酶、多肽等样品的非特异性吸附极小;因而广泛应用于生物大分子的分离。月旭Xtimate SEC填料即为此类型的色谱填料。目前已有120 ?、300 ?、500 ?和1000 ?等四种孔径尺寸规格的SEC色谱柱产品。国内外也有一些色谱柱厂家成功研发了该类型产品,例如TOSOH公司的TSK gel SW-型色谱填料、安捷伦公司的ZORBAX GF色谱填料。

  6、混合模式色谱填料。它是在一根色谱柱上实现两种或多种分离机理共同主导的色谱柱填料。混合模式色谱分离的基础是色谱固定相能同时提供多种作用力,如键合相同时包含烷基链和电荷中心,则可以提供疏水作用力和静电作用力,实现反相和离子交换混合模式色谱分离。由于多种作用力的存在,混合模式色谱可以显著地提高分离选择性,这样就可以实现根据样品的不同特性进行分离。月旭公司目前具有多种混合基质的色谱填料,例如C18/SCX、C18/SAX等。图7为月旭公司研发的C18/SCX色谱填料结构示意图。

  7、手性色谱填料。它是由具有光学活性的单体,固定在硅胶或其它聚合物上制成手性固定相。通过引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异,从而达到光学异构体拆分的目的。一个有效的手性填料应当具有能够快速分离对映体,测定对映体的纯度,尽可能适应多种类型的对映体的分离;应当具有较高的对映体分离选择性和柱容量。目前,手性填料主要有以下5大类: (1)多糖类手性色谱填料:主要包括纤维素和淀粉两大类手性固定相;(2)大环手性色谱填料:主要是用大环分子和环糊精、手性冠醚来形成的固定相;(3)糖肽类手性固定相:主要是用万古霉素、利福霉素B等制成的手性固定相;(4)多肽或蛋白质手性固定相;(5)配体交换手性固定相:建立在金属配合物的配体交换的基础之上的固定相。目前生产手性填料的国内外厂家有大赛璐、色谱科、菲罗门、广州研创、月旭等公司。

  8、最后,有机高分子基质液相色谱填料也是一个非常活跃的领域,主要分为多糖型基质填料和聚合物型基质填料。同硅胶基质的填料相比,此类填料具备高负载量、 高化学稳定性(耐酸 、耐碱、耐溶剂处理),对于生物大分子不易产生不可逆的非特性吸附作用等优点。这些优点决定了其广泛的应用前景,特别是生物大分子的分离和分析。一般来说,有机高分子基质色谱填料的柱效低于硅胶基质的填料。生产此类填料的国外厂家很多,例如GE、Tosoh (东曹)等,国内厂家这方面起步较晚,目前有纳微、赛分和月旭等。

  以上所述是色谱填料在技术方面的二大趋势,现在我们再来看看色谱柱和色谱填料的市场趋势。色谱柱的国内市场在过去的10年是一个快速发展的市场,这是因为色谱技术在国内的应用呈现了突飞猛进的势头。但是,色谱柱市场在发达国家是一个相对成熟和稳定的市场,虽然技术层面不断有新的创新,但是新的技术的出现并不是一下子推翻以前的技术,Waters 公司的Symmetry 色谱柱已有20几年的历史了,但市场上还是很多人用它。各个厂家的市场份额也相对稳定,新的色谱柱公司基本没有机会。国内市场不会马上达到像欧美国家那种稳定的状态,但是趋势是竞争的门槛在提高。

  一方面,和液相色谱仪相比,色谱柱这个细分产业是一个国内生产企业可以率先达到国际先进水平的行业,核心原因是色谱填料和色谱柱虽然也有较高的技术门槛,但是对专业的集成要求要低得多,主要是化学和材料,不需要机械、电子和软件方面的专长。一些有较好研发基础的厂家通过坚持不懈的努力和知识的积累,可以在几年内达到国际先进水平。目前,月旭公司大量销售的色谱柱产品主要的就是取代市场上知名国际品牌的产品。

  另一方面,色谱工作者对色谱柱产品的要求越来越高,四、五百美元的色谱柱,相比它的重要性,大多数情况下价钱不是问题。用户更关心的是色谱柱的重现性、寿命和选择性,甚至高于对柱效、拖尾因子等纯技术参数的关注。这就对厂家在产品质量管理和产品种类的丰富性方面提出了很高的要求。这二个方面都离不开产品研发能力和对色谱填料核心技术的掌握。产品质量方面,除了研发能力,还必须在各个生产环节,从原材料选材、键合工艺、装柱工艺到色谱柱出厂质量检测都要进行严格的控制。

  除了产品质量和产品种类,色谱柱厂家还要在色谱方法开发方面持续地进行投入,客户对色谱柱品牌的选择有一定的粘性,最有效的营销是靠应用去替换。客户不缺色谱柱,缺的是色谱分离分析的解决方案。注重应用开发的色谱柱厂家才能成为行业内公认的“色谱专家”,才能赢得客户的认可。

  我所创办的月旭材料科技(上海)有限公司和全资子公司浙江月旭材料科技有限公司专注于色谱填料和色谱柱产品的研发、生产、销售和技术服务,2005年推出月旭Ultimate 系列色谱柱,至今已经成功推出70种HPLC固定相。公司员工从当年拿着中科院化学所刘国诠老师编写的《色谱柱技术》一书给客户介绍月旭的色谱柱,一根一根给客户试用,到今天月旭色谱柱被数量众多的色谱工作者广泛接受,见证了中国色谱柱市场过去10年的快速发展。相信通过和国内同行共同的奋斗,我们能够使中国自主研发和生产的色谱柱产品在技术上和市场影响力上达到或超过国际知名品牌的水平,说得具体点就是在未来的5-10年内实现在中国市场国产色谱柱市场份额从现在的大约30%提高到70%,而且使国产的色谱柱出口的数量和产值超过从国外进口的色谱柱。

  (作者赵岳星博士是月旭公司创办人,国家“千人计划”入选者,现任月旭公司董事长和总经理。)

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